双荧光素酶系统实验操作步骤及方法_[宣贯].ppt下载

weixin_39820780 2021-11-03 16:13:50

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双荧光素酶系统实验操作步骤及方法_[宣贯].ppt

接下来，又通过StarBase在线数据库确定了miR-124-3p与LINC01234之间存在的潜在结合位点（图14B），并通过双荧光素酶报告基因检测实验进行了验证，结果证明，在U266细胞中，miR-124-3p上调抑制LINC01234报告质粒的荧光素酶活性，而在miR-124-3p结合位点突变后没有显著影响（图14B）。具体而言，pGL4系列载体是在pGL3载体骨架的基础上，重新设计了载体中从报告基因起始点到细菌的复制序列的起点，以减少共有转录因子结合位点的数量，从而降低异常表达的风险。

接下来，又通过StarBase在线数据库确定了miR-124-3p与LINC01234之间存在的潜在结合位点（图14B），并通过双荧光素酶报告基因检测实验进行了验证，结果证明，在U266细胞中，miR-124-3p上调抑制LINC01234报告质粒的荧光素酶活性，而在miR-124-3p结合位点突变后没有显著影响（图14B）。具体而言，pGL4系列载体是在pGL3载体骨架的基础上，重新设计了载体中从报告基因起始点到细菌的复制序列的起点，以减少共有转录因子结合位点的数量，从而降低异常表达的风险。

转化及质粒提取过程使用DH5α大肠杆菌感受态细胞进行转化，将公司送回的质粒干粉先于离心机顺式离心，然后加入适量的水进行溶解（因为质粒量很多也很好转染，这步加入多少的水对实验的结果都没有影响），然后再次顺式离心获得质粒溶液。购买的感受态细胞一般为100微升/支，取其中的三分之一作为质粒转化的量就足够了，即一管做三个转化。感受态细胞保存在-80℃的冰箱中，取出时必须置于冰箱进行融化。加入之前的质粒溶液3微升（不超过感受态细胞的十分之一），不允许吸打溶液，包括之前感受态细胞的分装也是。冰上孵育30-60 min

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